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分光光度計知識匯總二

提供來源:上海百賀 日期:2018年03月17日
一、測量條件的選擇
 
1.1 顯色反應及顯色條件的選擇
進行比色分析或光度分析時,首先要把待測組分轉變成有色化合物,然后進行比色或光度測定。將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應
 
1.1.1 顯色反應的選擇
顯色反應分兩類,即絡合反應和氧化還原反應,絡合反應是主要的顯色反應。
選用的原則是:
1)選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光系數(shù)ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標志,因此應當選擇生成的有色物質的ε較大的顯色反應。一般來說,當ε為104-105時,可認為該反應靈敏度較高。
2)盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數(shù)幾個組分發(fā)生顯色反應。
3)顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質大吸收波長之差稱為對比度,一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
4)反應生成的有色化合物組成恒定,化學性質穩(wěn)定。
 
1.1.2 顯色條件的選擇
吸光光度法測定的是顯色反應達到平衡后溶液的吸光度,因此要得到準確的結果,從研究平衡著手,了解影響顯色反應的因素,控制適當?shù)臈l件,使顯色反應完全和穩(wěn)定。
 
1)根據(jù)溶液平衡原理,有色絡合物的穩(wěn)定常數(shù)越大,顯d劑過量越多,越有利于待測組分形成有色絡合物。但是過量顯色劑的加入有時會引起副反應,對測定反而不利。
2)酸度對顯色反應的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反應的適宜酸度范圍是通過實驗來確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度,改變溶液pH值,測定其吸光度,作出吸光度-pH值關系曲線,選擇曲線平坦部分對應的pH值作為測定條件。
3)顯色反應一般在室溫下進行,有的反應需要加熱,以加速顯色反應,使之進行完全。
4)大多數(shù)顯色反應需要經(jīng)過一定的時間才能完成,其長短與溫度的高低有關,也會受到空氣的氧化或發(fā)生光化學反應使眼色顏色減弱。因此通過實驗作出在一定溫度下的吸光度-時間關系曲線,得到適宜的顯色時間。
 
1.1.3 干擾的消除
1)干擾的類型
光度分析中,
A.干擾離子本身有顏色
B.干擾離子本身無顏色,但能與顯色劑反應生成穩(wěn)定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定,若生成的配合物無色,也降低了顯色劑的濃度,
C.干擾離子與被測離子反應生成配合物或沉淀,影響被測離子的測定。
 
2)消除干擾的方法
A.控制溶液酸度。
B.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩(wěn)定的化合物,使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。
C.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
D.選擇適當?shù)墓ぷ鞑ㄩL以消除干擾。
E.采用適當?shù)姆蛛x方法。
 
1.2 吸光度測量條件的選擇
1.2.1 入射光波諾難≡瘺/div>
應根據(jù)吸收光譜曲線,選擇溶液具有大吸收時的波長作為入射光的波長。
如顯色劑與鈷絡合物在420nm波長處均有大吸收峰。如用此波長測定鈷,則未反應的顯色劑會造成干擾而降低測定的準確度。因此選擇在500nm波長處測定,
 
3.2.2 參比溶液的選擇
1)如果僅待測物與顯色劑的反應產(chǎn)物有吸收,可用純溶劑作參比溶液。
2)如果顯色劑或其他試劑略有吸收,應用空白溶液
3)如試樣中其他組分有吸收,但不與顯色劑反應,則當顯色劑無吸收時,可用試樣溶液作參比溶液,當顯色劑略有吸收時,可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑,以此溶液作參比溶液。
 
3.2.3 吸光度讀數(shù)范圍的選擇
實踐證明,吸光度在0.2-0.5內時,測量的相對誤差小。
可用兩種方法來調整被測溶液的吸光度:
1)控制被測溶液的濃度。如改變取樣量,改變溶液的濃縮倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。
2)選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿,吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
 
四、應用
 
4.1 應用領域
4.1.1高含量組分測定-示差法
當待測組分含量較高時,測得任舛戎黨3F肜什?比爾定律。即使不發(fā)生偏離,也因為通常采用純溶劑作參比溶液(普通光度法),使測得的吸光度太高,超出適宜的讀數(shù)范圍而引入較大的誤差。采用示差法就能克服這一缺點。
 
但應用示差法時,要求儀器光源有足夠的發(fā)射強度或能光電流放大倍數(shù),以便能調節(jié)參比溶液透光度為100%。這就要求儀器單色器質量高,電光學系統(tǒng)穩(wěn)定性好。
 
4.1.2 多組分分析
應用紫外可見分光光度法,常常可能在同一試樣溶液中不進行分離而測定一個以上組分。
假定溶液中同時存在兩種組分x和y,其吸收光譜一般有重疊和不重疊兩種情況。
1)不重疊的測定組分相互不產(chǎn)生干擾。
2)若吸收光譜重疊,在波長為λ1和λ2時分別測定吸光度A1和A2,由吸光度值的加和性得到聯(lián)立方程,通過解聯(lián)立方程求得各濃度值。
 
4.2 定量方法
紫外可見分光光度分析的定量依據(jù)是光吸收定律,但具體操作方法卻有多種
 
4.2.1 標準曲線法
即工作曲線法,
根據(jù)光吸收定律,對于一種有色化合物,ε是一個定值,若把光程L也固定,那么吸光度A就和溶液的濃度c成正比,也就是說吸光度A和濃度c呈線性關系。
配制一系列適當濃度的標準溶液,顯色直鴆舛ㄆ湮舛齲鹽舛華對濃度c作圖,即得工作曲線。
 
2.2.2 直接比較法
直接比較法其實質也是工作曲線法,是一種簡化的工作曲線法。
配一個已知被測組分濃度為cs的標樣,測其吸光度為As,在
As=εcsL
Ax=εcxL
由于溶液性質相同,比色皿厚度一樣,所以As/Ax=cs/cx
式中:
cs-已知被測組分的濃度,mol/L;
cx-未知樣品的濃度,mol/L;
As-已知被測組分的吸光度;
Ax-未知樣品的吸光度。
直接比較法簡化了繪制工作曲線的步驟,適用于個別樣品的測定。
操作時應注意配制標樣的濃度要接近被測樣品的
 
2.2.3 標準加入法
標準加入法是工作曲線的一種特殊應用。
選擇適當?shù)娘@色條件,先測定濃度為cx的未知樣品吸光度為Ax,再向未知樣品中加入一定量的標樣,配置成濃度為cx+Δc1、cx+Δc2……一系列樣品,分別顯色后再測定吸光度為A1、A2……在坐標紙上繪圖,以吸光度A為縱坐標,以濃度c為橫坐標,分別畫出Δc1、Δc2所對應的A1、A2等各點,連成直線后延長,與橫軸的交點cx也就是未知樣品的濃度cs。
 
應用標準加入法時要注意,加入的標樣濃度要適當,使畫出的曲線保持適當角度,濃度過大或過小都會帶來測量誤差。
 
這種方法操作比較麻煩,不適于作系列樣品分析,但它適用于組成比較復雜,干擾因素較多>又不太清楚的樣品,因為它能消除背景的影響。
 
2.3 紫外可見分光光度計使用中的注意點
2.3.1 保護光源
光源燈有一定的壽命,儀器不工作時不要開燈,若工作間歇時間短,可不關燈。
一旦停>,則要待燈冷卻后再重新啟動,并預熱15min。
燈泡發(fā)黑或亮度明顯減弱或不穩(wěn)定時,就及時更換。
經(jīng)經(jīng)紫外光照射后形成結痕可用無水乙醇去除。
 
2.3.2 保證合適的工作環(huán)境
溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。
不適宜的溫度和濕度可引起機械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機械部分的誤差或性能下降;
 
造成光柵、反射鏡、聚焦鏡等光學部件的鋁膜銹蝕,產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等;
甚至使儀器停止工作,從而影響儀器壽命。維護保養(yǎng)時應定期加以校正溫度和濕度。
 
實驗室,特別是地處南方地區(qū)的實驗室,應具備四季恒溫的儀器室,配備恒溫設備。
環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關、按鍵、光電耦合器的可靠性,也是造成光學部件鋁膜銹蝕的原因之一。
 
因此定期清潔,保障環(huán)境和儀器內衛(wèi)生條件,防塵。
 
2.3.3 定期除塵、調校
 
2.3.4 正確使用比色皿
拿比色皿時,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。
清洗比色皿時,先用水沖洗,再用蒸餾水洗凈。若被比色皿被有機物沾污,可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1:2)浸泡片刻,再用水沖洗。每次做完實驗應立即洗凈比色皿。
比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干,以保護透光面。
 
測定有色溶液吸光度時,一定要用有色溶液洗比色皿內壁幾次,以免改變有色溶液的濃度。在測定一系列溶液的吸光度時,通常都按由稀到濃的順序測定,以減少測量誤差。
若分光光度計噪音比較大,有可能是光源燈泡使用時間超過壽命期,可更換光源燈泡。
若自檢時提示波長自檢出錯,有可能是自檢過程中打開過儀器樣品室的蓋子,
 
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