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分光光度計(jì)知識(shí)匯總一

提供來(lái)源:上海百賀 日期:2018年03月17日
 
分光光度法是指應(yīng)用分光光度計(jì)的分析方法,具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及選擇性好等特點(diǎn)。
 
通常所測(cè)樣品溶液濃度下限可達(dá)10-6~10-5mol/L,適用于測(cè)定食品中的微量組分(如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等)。
一、原理
 
1.1 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收
當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時(shí),光與物質(zhì)發(fā)生相互作用,產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均勻溶液,光的散?可以忽略。
 
1.1.1 溶液顏色的產(chǎn)生
當(dāng)一束白光通過(guò)某一有色溶液時(shí),一些波長(zhǎng)的光被溶液吸收,另一些波長(zhǎng)的光則透過(guò)溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺(jué)到的光定義為可見(jiàn)光。
 
在可見(jiàn)光區(qū),不同波長(zhǎng)的光呈現(xiàn)不同的顏色,因此溶液的顏色由透射光的波長(zhǎng)所決定。
透射光與吸收光可組成白光,故稱這兩種光互為補(bǔ)色光,兩種顏色互為補(bǔ)色。
 
1.1.2 光吸收的本質(zhì)
當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時(shí),組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”,光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上,是這些粒子由低能態(tài)(基態(tài))躍遷到較高能太(激發(fā)態(tài)),這個(gè)作用稱為物質(zhì)對(duì)光的吸收。
 
被激發(fā) 粒子約在10-8s后回到基態(tài),并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級(jí),僅當(dāng)照射光光子的能量hυ,與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時(shí),才能發(fā)生吸收。
 
不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級(jí),其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。
所以物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。
 
1.1.3 吸收曲線
吸收曲線,也稱為吸收光譜,描述了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收辛
 
不同濃度的同一物質(zhì),在吸收峰附近的吸光度隨
 
因此,吸收曲線是分光光度法中選擇測(cè)定波長(zhǎng)的重要依據(jù)。
 
1.2 光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律:
當(dāng)一束平行單色光通過(guò)液層厚度為b的有色溶液時(shí),溶質(zhì)吸收了光能,光的強(qiáng)度就要減弱。
溶液的濃度越大,通過(guò)的液層厚度越大,入射光越強(qiáng),則光被吸收的越多,光強(qiáng)度的減弱也越顯著。
 
該定律是紫外可見(jiàn)分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù),是由實(shí)驗(yàn)觀察得到的,不僅適用于溶液,也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度;
I0-入射光強(qiáng)度,cd;
I-透射光強(qiáng)度,cd;
ε-吸光系數(shù),L/(mol˙cm);
b-液層厚度(光程長(zhǎng)度),cm;
c-有色溶液的濃度,mol/L。
 
其物理意義為:當(dāng)一束平行單色光通過(guò)單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)v液時(shí),溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
 
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)和溶劑的情況下的一個(gè)特征常數(shù),數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度,ε值越大,方法的靈敏度越高。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算ε時(shí),常以被測(cè)物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度,實(shí)際上時(shí)表觀摩爾吸光系數(shù)。
 
在多組分體系中,如果各種吸光物質(zhì)之間沒(méi)有相互作用,體系的總吸光度等
透光度T是透射光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度I0之比,即:
T=I/I0
因此:A=lg(1/T)
 
二、主要部件
 
盡管光度計(jì)種類型號(hào)繁多,但它們都是由相同的基本部件組成的,包括光源、單色器、吸收池和檢測(cè)系統(tǒng)。
 
2.1 光源
在測(cè)量吸光度時(shí),要求光源發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜,要具有足夠的光強(qiáng)度,并在一定時(shí)間內(nèi)能保持穩(wěn)定。在可見(jiàn)光區(qū)測(cè)量時(shí),背J褂夢(mèng)偎康譜魑庠礎(chǔ)N偎考尤鵲槳壯闋刺被岱⒊霾ǔぴ?20~2500nm之間的連續(xù)光譜。
 
鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K,熔點(diǎn)為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓,電源電壓的微小波動(dòng)會(huì)引起鎢燈光強(qiáng)度的很大變化,因此使用穩(wěn)壓電源。
 
在紫外區(qū)測(cè)量時(shí),常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生波長(zhǎng)在180~375nm之間的連續(xù)光譜作為光源。
其理想光源應(yīng)具有覆蓋整個(gè)紫外可見(jiàn)光區(qū)的連續(xù)輻射,強(qiáng)度應(yīng)比較高,且隨波長(zhǎng)變化能量變化不大,但在實(shí)際上難以實(shí)現(xiàn)。
 
氘燈輻射強(qiáng)度比氫燈高2~3倍,壽命也比較長(zhǎng)。氙燈的強(qiáng)度一般高于氫燈,但欠穩(wěn)定,波長(zhǎng)范圍180~1000nm,常用作熒光分光光度計(jì)的激發(fā)光源。
 
2.2 單色器
單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成:入光狹縫、準(zhǔn)光氣(一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束)、色散器、投影器(一般由一個(gè)透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫)、出光狹縫。
 
色散器是單色器的核心部分,常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成,玻璃棱鏡色散能力強(qiáng),但吸收紫外光,只能用于350-820nm波長(zhǎng)的分析測(cè)定,在紫外區(qū)用石英棱鏡。
 
光柵的特點(diǎn)是:色散均勻,呈線性,光度測(cè)量便于自動(dòng)化,工作波段廣。
 
2.3 吸收池
也稱為比色皿,是盛放樣品溶液的容器,具有兩個(gè)互相平行、透光且具有厚度的平面。玻璃吸收池光程長(zhǎng)度一般為1cm,也有0.1-10cm的。
 
由于吸收池厚度存在一定誤差,其材質(zhì)對(duì)光不是完全透明,在做定量分析時(shí),對(duì)吸收池應(yīng)做配套性試驗(yàn),試驗(yàn)后標(biāo)記出放置方向。紫外光區(qū)數(shù)值不跳為石英。
 
2.4檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)系統(tǒng)包括檢測(cè)器和記錄顯示裝置。檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備,將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)顯示出來(lái)。常用的檢測(cè)器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測(cè)器等。
 
光電池的光電流較大,不用放大,用于初級(jí)的分光光度計(jì)上,疲勞效應(yīng)嚴(yán)重。
光電倍增管利用二次電子發(fā)射來(lái)
光二極管陣列檢測(cè)器由于全部波長(zhǎng)同時(shí)被檢測(cè),掃描速度快,可在0.1s內(nèi)完成對(duì)190-800nm波長(zhǎng)范圍的掃描。
 
記錄顯示裝置包括放大器和結(jié)果顯示裝置。70年代采用數(shù)字讀出裝置。
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