藥品原料藥和制劑的生產(chǎn)過程中，不可避免地會產(chǎn)生或引入影響藥物穩(wěn)定性甚至威脅人類健康的雜質(zhì)，比如在血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)、雷尼替丁及其他藥物中發(fā)現(xiàn)潛在致癌物-亞硝胺雜質(zhì)。1987年亞硝胺類化合物（NAs）被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列入致癌物清單，2017年國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）評估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)的ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險高的NAs列為“關(guān)注隊列”。
在酸性條件下，若仲胺、叔胺或季胺和亞硝酸鹽同時存在，則有可能形成亞硝胺。藥物原料藥生產(chǎn)過程中采用的起始原料、試劑、催化劑、溶劑、中間體以及被污染的設(shè)備和試劑都有可能造成亞硝胺雜質(zhì)的生成。此外，藥物制劑過程中采用的輔料以及藥物因儲藏條件而發(fā)生氧化、分解等反應(yīng)也會在藥物中引入亞硝胺雜質(zhì)。其中有機溶劑在API生產(chǎn)及藥品的分離、純化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，根據(jù)FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）和EMA（歐洲藥品監(jiān)督管理局）的指導(dǎo)原則，藥品生產(chǎn)過程中使用的有機溶劑是亞硝胺雜質(zhì)的潛在根源之一。因此對藥物及藥品生產(chǎn)使用有機溶劑中亞硝胺類雜質(zhì)的種類、含量測定和成因分析，近年來已成為制藥行業(yè)關(guān)注的要點。
為應(yīng)對亞硝胺危機，USP（美國藥典委員會）經(jīng)方法測試及風(fēng)險評估后建立了幾個亞硝胺參考標(biāo)準(zhǔn)，并發(fā)布了新的《美國藥典—國家處方集(USP-NF) 》通則<1469>亞硝胺雜質(zhì)，以支持行業(yè)分析和監(jiān)測藥品供應(yīng)鏈中的亞硝胺。2020年版《中國藥典》四部通則9306亦有體現(xiàn)，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心并于2020年5月8日發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2020年1號）。
FDA曾報告了一種采用GC-MS/MS結(jié)合直接進樣的方法測定有機溶劑中NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA和NDBA等亞硝胺雜質(zhì)，但對于未知雜質(zhì)較多的商用級溶劑的分析中，對于未知雜質(zhì)干擾的排除及未知雜質(zhì)與亞硝胺雜質(zhì)峰的分離度方面還面臨一些挑戰(zhàn)。基于此，USP使用島津高靈敏度GCMS-TQ8050 NX三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)開發(fā)了一種高靈敏度的GC-MS/MS分析方法，用于二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中同時測定六種亞硝胺雜質(zhì)(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA和NDBA)，并驗證了該方法的有效性。
儀器和分析條件
溶液和樣品制備
注：所有溶液均在棕色容量瓶中配制
結(jié)果與討論
1.方法開發(fā)
商用溶劑中存在較多的干擾雜質(zhì)以至于影響亞硝胺的準(zhǔn)備識別，通過優(yōu)化MRM離子對、碰撞能量以減少未知雜質(zhì)的干擾（MRM條件優(yōu)化結(jié)果見下表1），此外對柱溫程序也進行優(yōu)化，并改變檢測器增益（0.8kv）以提高方法的靈敏度（相對于商用溶劑樣品濃度達到100 ppb）。同時對于樣品濃度，經(jīng)測試樣品濃度為25 mg/mL時可以減少干擾并保持高的靈敏度。由于亞硝胺的原位形成，GCMS使用的高溫可能會導(dǎo)致亞硝胺測試結(jié)果偏高。通過空白進樣，未觀察到亞硝胺出峰位置有干擾。此外室溫下48h穩(wěn)定性測試亦未發(fā)現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)發(fā)生變化。
進一步使用分析級溶劑對方法進行驗證，再次證實了原FDA方法商用溶劑中未知雜質(zhì)影響了分析方法的靈敏度，其中相對于100 mg/mL的樣品濃度NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA的LOQ為5 ppb，NDBA的LOQ為13 ppb。與FDA報道的方法相比，優(yōu)化后的方法對不同純度溶劑樣品中亞硝胺的分析具有良好的分離度和高靈敏度。
表1 6種亞硝胺的MRM條件（離子對、CE值、掃描時間）
注：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（NEIPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二苯胺（NDPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）
2.方法學(xué)驗證
用所建立的GC-MS/MS方法對二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑和分析級溶劑中的6種亞硝胺進行測定，驗證標(biāo)液濃度完全覆蓋FDA相關(guān)限值要求，通過色譜分離專屬性、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間準(zhǔn)確度等多個指標(biāo)驗證了該方法的可靠性。驗證方法及結(jié)果分見表2和圖2 。
表2 方法學(xué)驗證程序及結(jié)果
RLL-低濃度水平加標(biāo)回收率（5 ppb* (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和13 ppb*(NDBA) ）
RML-中濃度水平加標(biāo)回收率（1000 ppb* ）
RUL-高濃度水平加標(biāo)回收率（2000 ppb*）
*：相對于100 mg/mL的樣品濃度
圖2 （A) LOQ溶液色譜圖 （0.5 ng/mL (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和1.3 ng/mL (NDBA)）
(B) MRM-1和MRM-2提取離子色譜圖
3.樣品分析
使用經(jīng)驗證的方法對二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲苯被550 ppb的NDEA污染，鄰二甲苯被120 ppb的NDEA和3400 ppb的NDBA污染。在上述商用溶劑和其他分析級的二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑中未檢測到亞硝胺。
總結(jié)
溶劑在制藥工業(yè)中被廣泛用作原料藥和制劑的反應(yīng)介質(zhì)和其他步驟。溶劑生產(chǎn)和運輸過程中添加的化學(xué)品、生產(chǎn)過程中的污染以及溶劑回收等都是商用溶劑中亞硝胺的潛在來源。USP使用島津高靈敏度的GCMS-TQ8050 NX系統(tǒng)開發(fā)了在藥品生產(chǎn)中廣泛使用的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中的六種亞硝胺的高靈敏度的檢測方法，該方法對于商用級和分析級溶劑都能實現(xiàn)滿意的檢測效果。
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