本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）實現尤文（尤因）肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節觀察，從而協助本研究的進行。活細胞成像等技術在了解腫瘤進展和轉移研究中至關重要。真核細胞中的有絲分裂紡錘體由中空的微管組成。它在有絲分裂期間的細胞內重復染色體分離和分裂細胞細胞骨架結構的構建過程中發揮著重要的作用。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中，有絲分裂障礙的觸發因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認。
簡介
使用熒光顯微鏡可以研究腫瘤形成和進展過程中組織及細胞內部發生的變化。像活細胞成像這樣的技術對更加深入地了解腫瘤進展和轉移是至關重要的。
在真核細胞中，由中空微管組成的有絲分裂紡錘體，有助于構建復制細胞的細胞骨架結構，并在有絲分裂過程中將復制的染色體從原始細胞中分離出來。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中，有絲分裂障礙的觸發因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認[1]。
肉瘤是肌肉或骨骼等結締組織中形成的一類腫瘤。尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤，分別生長于骨骼和肌肉中，是一種傾向于發生在骨骼生長活躍區域附近的兒科腫瘤。除了手術和化療之外，電離輻射也被用于治療這類腫瘤，但這可能會導致生長中的骨骼受到yong久性損傷，包括不對稱生長停滯、脛骨畸形及骨折概率增加等。骨骼損傷的嚴重度在很大程度上與骨骼接受的輻射劑量成正比。因此，我們有理由認為，選擇性放射致敏腫瘤組織的策略可降低實現局部控制所需的輻射劑量，并能很大限度降低對鄰近健康組織造成的間接損傷。
運用體外研究和小鼠異種移植模型系統，對使用mRNA合成壓制劑光神霉素A預處理，可以通過改變輻射損傷的轉錄反應實現選擇性放射致敏EWS：Fli1+腫瘤細胞的假設進行了驗證[2]。結果表明，光神霉素A可以通過壓制參與DNA損傷修復相關基因的轉錄，使EWS：Fli1+細胞在體內外顯著放射增敏，導致腫瘤細胞程序性死亡[2]。
使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節，協助癌癥研究人員獲得更有用的見解。
挑戰
在有絲分裂紡錘體成像中，可對其實現快速成像，并獲得清晰的高對比度3D成像，以清晰展示重要細節的解決方案很實用。傳統的寬場顯微成像速度快，檢測靈敏度高，但不幸的是對于厚樣本的成像通常會出現失焦不清晰或模糊的情況，這會降低對比度[3]。要闡明有絲分裂的不穩定性在癌癥等復雜疾病中的作用，這需要在同一樣本中進行多個關聯生物學標記。
方法
該研究中使用了尤文肉瘤細胞（SK-ES-1）。對這些細胞進行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀釋/ Dylight 488偶聯驢抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀釋/Dylight 550偶聯驢抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342藍）進行染色。染色后，使用介質ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）進行蓋玻片封片，并通過使用63×/1.4 NA（數值孔徑）的油鏡進行THUNDER Imager Tissue成像。圖像采集使用大體積成像解析（LVCC）[3]模式，并生成zui大化投影圖像數據。
結果
在有絲分裂過程中，α-微管蛋白（綠色）形成有絲分裂紡錘體，染色單體（藍色）會附著在有絲分裂紡錘體上，而γ-微管蛋白（紅色）集中定位在分裂細胞中的紡錘上。通過THUNDER技術可觀察到肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節。清晰的圖像可以展示清晰的結構，以便進行分割和進一步的分析。
圖1：尤文肉瘤細胞SK-ES-1 α-微管蛋白（綠色）、γ-微管蛋白（紅色）和DNA（藍色）染色后的很大化投影：原始圖像數據（左）和THUNDER LVCC模式成像數據（右）。
結 論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]進行尤文肉瘤細胞中的有絲分裂紡錘體成像時可顯著增強對比度。與傳統的寬場成像相比，其可展示細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節。
References：
1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Muñoz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.
2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
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