引言
中國疾病預防控制中心營養與健康研究所、寧波大學食品與藥學院中國食品科學與技術系、島津企業管理(中國)有限公司聯合研究，成功建立并驗證了適用于血清中多種維生素D代謝物的高通量、高靈敏度SFC-MS/MS分析方法。
由于研究內容較多，故分為上、下兩期來進行詳細介紹。本期主要介紹內容為：研發背景、樣品前處理、如何建立及優化SFC-MS方法等。
文章出處
Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23
島津Nexera UC全相系統之SFC-MS系統
本研究采用島津超臨界流體色譜儀Nexera UC、島津三重四極桿液質聯用儀LCMS-8060
超臨界流體與改性劑配合使用，可在更大范圍內滿足不同極性化合物的檢測需要；
低死體積和背壓控制單元有效降低脈動，提高靈敏度；
溶劑使用量少且分析時間短，是一種綠色環保、有效的分析手段。
研究背景
維生素D（VD）作為一種脂溶性類固醇，在鈣穩態和骨骼健康中起著重要作用，其主要以麥角鈣化醇（VD2）和膽鈣化醇（VD3）兩種形式存在，多通過皮膚光照和食物或膳食補充劑來獲取。VD進入體內參與生物調控，須在肝臟及腎臟內進行羥基化等復雜的代謝途徑反應，因此其代謝產物結果是VD臨床評價的主要挑戰之一。
對于正常人血清或血漿中含有痕量1,25-(OH)2 VD2和1,25-(OH)2 VD3，分析時應考慮進一步改進定量限(如衍生化)。與LC-MS/MS法相比，采用超臨界流體色譜儀（SFC）作為質譜前端，不僅降低了有機溶劑成本，還有具有更快分析速度及更高靈敏度。
樣品前處理
采用3.5 mL真空血管采集空腹血樣，凝固后1500 ×g離心30 min。上層血清移入無菌管，-80℃保存后用于分析。
建立及優化SFC-MS分析方法
1. SFC色譜柱的選擇
考察了10種VD代謝物分別在Diol、CN、NH2、PFP和C18 5根色譜柱上的洗脫性能，并評價了不同固定相的選擇性。如圖1，除C18柱外，其他4根色譜柱上VD代謝產物色譜峰均為正常的洗脫順序，保留時間隨羥基數量的增加而增加。其中PFP柱能夠分離所有VD代謝產物，分離效果較好，特別是25-OH VD2/VD3及其對映體的分離，并被選擇用于進一步開發。
圖1：A) Diol, B) CN, C) NH2, D) PFP, E) C18色譜柱上VD代謝產物的固定相化學結構和洗脫順序。
1: 25-OH VD3和3-epi-25-OH VD3;
2: 25-OH VD2和3-epi-25-OH VD2;
3: VD3;
4: VD2;
5: 1,25-(OH)2 VD3;
6: 1,25-(OH)2 VD2;
7: 24，25-(OH)2 VD3;
8: 24，25-(OH)2 VD2。
2. 梯度洗脫條件優化
純CO2是VD代謝物的弱洗脫溶劑，與固定相相互作用強。因此，為提高流動相的洗脫強度，加入甲醇作為改性劑。圖2顯示了四種不同梯度下VD代謝物的分離情況。
在Gradient 4條件下，二羥基代謝物的峰形明顯改善，這可能是由于甲醇比例的急劇增加(1.5 min內從8%增加到40%)改善分離效果，由此減少二羥基代謝物的擴散。因此，選擇Gradient 4進行進一步優化。
圖2：四種梯度洗脫程序(流動相A: CO2;流動相B:甲醇，色譜柱：PFP)
虛線(-)：流動相B的百分比；USP：分離度。(1-8序號對應VD代謝物名稱同圖1)
3. 流速的選擇
雖然超臨界流體黏度較低，但擴散系數較高。因此，在柱前壓力和洗脫液密度較高，設定較高流速時，梯度有望提高峰之間分離度。圖3(A)為不同流速下VD代謝物的洗脫。當流速從1.0 mL/min增加到1.5 mL/min時，25-OH VD2/ VD3及其表異構體的分離明顯改善，但當流速增加到2.0 mL/min時，分離度降低。因此后續研究設定流速為1.5 mL/min。
4. 柱溫的選擇
色譜柱溫度影響流動相粘度和界面分布。如圖3(B)所示，溫度從30℃升高到40℃，25-OH VD2/VD3及其同位異構體的分離得到改善，但溫度再升高到50℃，分離效果較差。因此后續研究采用柱溫40℃。
圖3 A）流速和B）溫度對PFP柱上VD代謝物分離的影響。
5. MS系統優化
為提高VD代謝物的電離效率，對離子源類型和補償劑緩沖液濃度進行了優化。對于離子源的選擇，測試了電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)，兩者都是在正離子模式下。如表1，濃度為1 ng/mL的所有VD代謝物，ESI+模式下的信噪比(S/N)比APCI+模式下的高4~6倍。因此, 在ESI+模式下評估不同濃度緩沖液，當甲酸銨濃度從1 mM增加到5 mM, S/N較好；將甲酸濃度從0.5‰(v/v)提高到1% (v/v)可進一步優化靈敏度，但甲酸濃度為2‰ (v/v)則沒有進一步提高靈敏度。因此，采用ESI+進行電離，選擇5 mM甲酸銨和1‰ (v/v)甲酸作為補償劑。
表1 離子源類型和緩沖液對維生素D代謝物信噪比(S/N)的影響(1 ng/mL)
FA: 甲酸; AmFc: 甲酸銨
本期小結
本研究建立了適用于血清中多種維生素D代謝物的SFC-MS方法，并通過優化分析條件，確定較好分析條件為：PFP色譜柱、梯度程序4、流速1.5mL/min、柱溫40℃，離子源類型為ESI+，補償劑為 5 mM甲酸銨和1‰ (v/v)甲酸。基于此分析條件下，可實現PFP柱可在10 min內10種VD代謝物的基線分離;在正電噴霧電離模式下進行檢測，允許對血清基質中的多種VD代謝物進行定量分析。
下一期將介紹方法驗證 、 SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法的方法比較，敬請期待！
